Ferramentas

-Coleta:para a análise de dados ser satisfatória, a amostragem tem de ser muito vasta e diversificada. Quanto mais metadados forem coletados em um mesmo habitat, mais ricas e precisas serão as informações obtidas: por exemplo, se houver alguma espécie dominante no habitat, e não houver um número de amostras suficiente, a dominância de tal espécie pode afetar as análises, pois uma representação maior significa uma maior chance de montar contigs.

-Obtenção de sequências:Uma vez que as amostras foram coletadas, é preciso isolar o DNA desses exemplares: nessa etapa, o protocolo utilizado na extração depende do tipo de amostra que está sendo analisada. Uma vez que o DNA metagenômico foi extraído, ele é clonado (via reação em cadeia da polimerase – PCR) e os fragmentos amplificados (produtos de PCR) são inseridos dentro de um vetor que pode ser um plasmídeo, cosmídeo, BAC, etc.Esses vetores contendo os fragmentos de amplificação são inseridos em bactérias, num processo chamado de transformação para contruir uma biblioteca metagenômica. Com a biblioteca pronta, um screening (prospecção) é feito por clones positivos, que uma vez encontrados são sequenciados.

- Montagem de genomas:A montagem para análises de metagenômica pode ser fieta de duas maneiras diferentes: ou por um método chamado de “montagem baseada em referência” que é feito por algoritmos rápidos como o Newbler, AMOS e o MIRA e tem como característica principal o fato de as regiões divergentes (como inserções, deleções e polimorfismos) não são cobertas. O outro método é o de montagem “de novo” que é realizado por softwares como o Velvet, MetaVelvet, SOAP, etc. Esse método é baseado nos gráficos de Bruijn, útil na eliminação de erros e repetições.

Mesmo com algoritmos avançados, a montagem de metagenomas ainda apresenta certas limitações: como o problema da amostragem ser incompleta acarretando em genomas incompletos, a formação de quimeras (sequências de espécies diferentes), etc.

Os algoritmos empregam dois tipos de informações em uma sequência de DNA para montar genomas : a classificação composicional e a similaridade.

A classificação composicional se baseia na propriedade que os genomas tem de ter sua composição de nucleotídeos conservada, portanto isso reflete na composição dos fragmentos de sequência dos genomas.

- Parâmetros analisados: o conteúdo de CG, o uso de códons, e sítios de reconhecimento (para rRNA 5S ou 16S)

- Ferramentas de boinformática utilizadas: Phylopythia, S-GSCM, TACAO, etc.

A similaridade das sequências, ou seja, comparam leituras curtas com sequências codificadoras de bancos de dados públicos e então determina um ancestral comum mais tardio (LCA) de um organismo alvo.

 

- Ferramentas utilizadas: IMG/M, MG-RAST, etc.

-Análise de dados:como as informações em metagenômica são cada vez mais abundantes, banco de dados são necessários para cobrir  as informações taxonômicas e funcionais, ou seja, para a análise de dados metagenômicos são necessárias plataformas computacionais complexas combinadas com programas de pesquisa de similaridade adaptados a esses dados.

- Anotação metagnômica: pode se dar pela análise de contigs longos (>30000 pb) ou de contigs curtos.

Analise de contigs longos: com programas como RAST ou IMG .

Análise de contigs curtos: são necessárias duas fases de análise: a primeira de identificação de possíveis genes, feita com algortimos como o FragGeneScan, MetaGeneMark, MetaGeneAnotador, enquanto na segunda fase é atribuída função para o gene e é feito o agrupamento taxonômico.

Análise via pipeline: Pipeline é um sistema aberto que trabalha linearmente e que processa automaticamente as sequências de metagenomas, faz comparações com bases de dados existentes, computa reconstruções filogenéticas e classifica funcionalmente potenciais genes, um exemplo de pipeline é o MG-RAST que utiliza bancos de dados como o GO (gene onthology), o KEGG, entre outros. Outro pipeline utilizado é o CAMERA que oferece um esquema de anotação mais flexível e também requer o uso do mesmo worflow para análise.